Luego de la batalla de Caseros en 1852 y la consecuente derrota de la provincia de Buenos Aires, se inició un proceso de conformación de una unidad política de carácter nacional. La existencia de esta nueva unidad política, la Confederación, implicó la reestructuración de todas aquellas atribuciones que tenían anteriormente las provincias como estados independientes, como la facultad para admitir moneda propia, establecer sus aduanas y dictar su legislación. En el artículo 15 del Acuerdo de San Nicolás, celebrado entre las provincias en 1852 y rechazado por Buenos Aires, se estableció que "los derechos de aduana exterior e interior ser[ía]n percibidos por cuenta de la Confederación Argentina, y su producto ser[ía] destinado al sostenimiento de los gastos generales de la Nación”.
El 5 de agosto de 1852, Rosario fue elevada al rango de ciudad por el gobierno de la provincia de Santa Fe, a pedido de Justo José de Urquiza -director provisorio de la Confederación Argentina-, con la intención de crear un poderoso centro que pudiera contrarrestar desde el interior a la poderosa ciudad de Buenos Aires. Unos días más tarde, el 23 de agosto, el gobierno de la Confederación estableció el “Reglamentó de aduanas” y declaró puerto habilitado con aduana al puerto de Rosario. Esta medida fue complementada con la declaración de la libre navegación de los ríos Paraná y Uruguay y sus puertos habilitados en la provincia a los de Rosario y Santa Fe del día 3 de octubre.
Con la nacionalización de las aduanas y la consecuente supresión de las aduanas interiores, las oficinas de aduana y resguardo del puerto de Rosario adquirieron una importancia estratégica y comercial. A su vez, los cambios en el ámbito comercial y financiero posibilitaron su conexión directa con los mercados internacionales y una mayor integración en los circuitos comerciales de las provincias del interior. Gracias a este contexto, se generó un gran crecimiento demográfico y la instalación de numerosas entidades comerciales y financieras.
Con la unificación nacional bajo el liderazgo de Buenos Aires en 1862, inició el proceso de construcción del estado nación. La Aduana de Rosario quedó definida en las Ordenanzas de Aduana de 1866 como una aduana marítima de depósito, por encontrarse sobre un río navegable, habilitada a crear su propio destacamento de resguardo para facilitar operaciones de circulación interna de mercancías.
Históricamente, la Aduana de Rosario dependió de los siguientes organismos estatales: Dirección General de Rentas (desde 1877, ley 904, dentro del Ministerior de Hacienda). Luego fue Dirección General de Aduanas (decreto 141, 1931), luego Administración General de Aduanas y Puertos de la Nación (ley 12.964, 1947). Luego Dirección Nacional de Aduanas (decreto 8803/49), luego Administración Nacional de Aduanas (decreto 6979/69). Disuelta en 1997 por decreto 618 de creación de la Administración Federal de Ingresos Públicos. Estos organismos tuvieron las siguientes funciones: Facultades de esta entidad: reglamentar los servicios de recaudación de derechos aduaneros y tasas portuarias, revisar los documentos aduaneros y portuarios que las aduanas y receptorías deben elevarle, aprobar o observar los estados demostrativos de las mercancías introducidas por los puertos, completar y armonizar las funciones aduaneras y portuarias (ley 12.964).